Да будет свет - редкий взгляд на жизнь наших кишечных бактерий
Наши кишечные бактерии влияют на множество физиологических процессов, включая иммунный ответ организма. В этой статье мы описываем метод маркировки анаэробных кишечных бактерий флуоресцентным маркером, который отражает свет при освещении, подобно светоотражателям на наших велосипедах. Этот маркер можно определить с помощью специального микроскопа. Используя этот маркер, мы можем выступать в роли детективов и отслеживать активность наших кишечных бактерий в их естественной среде. Этот метод позволил нам увидеть взаимодействие бактерий с различными клетками иммунной системы и то, где бактерии предпочитают селиться в пищеварительной системе.
Бактерии нашего кишечника
В пищеварительной системе человека обитает около 1,5 килограмма бактерий, называемых микробиотой, которые мирно живут внутри нас. Большинство из этих бактерий не вредны и даже помогают нам справиться с вредными бактериальными захватчиками или вирусами. В процессе эволюции у этих бактерий сложились важные отношения с иммунной системой, в которых они оказывают значительное влияние на ее развитие и функционирование. Однако когда эти отношения выходят из равновесия, могут развиться многие заболевания. Поэтому очень важно изучать состав микробиоты и взаимодействие этих бактерий с клетками организма.
Бактерии - это одноклеточные организмы. Их клетки покрыты жесткой стенкой, которая защищает их и необходима для выживания. Клеточная стенка бактерий построена из слоев пептидогликанов, которые представляют собой крупные молекулы, состоящие из сахаров и белков. Бактерии можно разделить на две основные группы по составу клеточной стенки. Одна группа называется грамположительными, а вторая - грамотрицательными бактериями. Они названы в честь датского врача Ханса Кристиана Грама, который разработал специальный метод окрашивания, позволивший ему различать эти две группы. У грамположительных бактерий толстая оболочка, состоящая из множества слоев пептидогликанов. У грамотрицательных бактерий оболочка тоньше - она состоит из нескольких слоев пептидогликанов, но содержит особый слой, состоящий из сахаров, белков и жиров. Эти крупные молекулы находятся снаружи клеточной стенки и используются для связи с окружающей средой. Клетки иммунной системы человека умеют распознавать эти специфические молекулы, и именно так некоторые бактерии могут взаимодействовать с организмом и активировать его иммунный ответ.
Один из видов грамотрицательных бактерий, называемый Bacteroides fragilis, является распространенным видом бактерий в кишечнике человека. Она покрывает себя слоем уникальных сахаров. Эти сахара могут "разговаривать" с иммунной системой человека и снижать ее активность, тем самым защищая нас от различных воспалительных заболеваний, вызванных гиперактивной иммунной системой. Поскольку B. fragilis так распространена и важна для сбалансированной микробиоты кишечника, мы решили сосредоточиться на ней в наших экспериментах.
Отслеживание бактерий с помощью флуоресцентного белка
Самый распространенный метод отслеживания биологических процессов - использование белка под названием зеленый флуоресцентный белок (GFP). Этот белок был впервые обнаружен в светящихся медузах в морских глубинах, и теперь его используют исследователи по всему миру. В лаборатории мы можем вводить этот белок в бактерии, чтобы заставить их светиться, что позволяет нам видеть и отслеживать их (рис. 1).
У GFP есть одно существенное ограничение, когда речь идет об изучении микробиоты кишечника - для свечения GFP необходим кислород, а в глубине кишечника есть множество областей, которые почти полностью лишены кислорода. Эти области называются анаэробными - в них вообще нет кислорода. Поэтому большинство бактерий, живущих в кишечнике, являются анаэробными. Для существования этих бактерий необходима бескислородная среда, и некоторые из них могут даже погибнуть, если на них попадет кислород. Поэтому мы искали другой метод, который позволил бы нам добавить флуоресцентный маркер к анаэробным бактериям, таким как B. fragilis, в отсутствие кислорода.
Когда думаешь о бактериальной клетке, ее можно представить себе как огромный химический завод. В ней одновременно происходит множество различных процессов, протекают многочисленные химические реакции, вещества переносятся из одного места в другое, и все это с очень точным регулированием и удивительным порядком. Когда мы хотим изучить биологические процессы, мы стараемся не вмешиваться в то, что происходит в клетке. Для этого в данном исследовании мы флуоресцентно пометили бактерии внешними молекулами, которые обычно не присутствуют в клетке и поэтому не мешают естественным процессам внутри бактерий.
Новый метод получения флуоресцентных бактерий
Вот детали разработанного нами процесса, позволяющего сделать бактерии флуоресцентными в бескислородной среде (рис. 2) [ 1 ]. На первом этапе синтезируется молекула сахара, связанная с азидной группой [ 2 ]. Азид очень активен, то есть быстро вступает в реакцию с другими химическими соединениями. На втором этапе бактериям скармливают питательную пищу, содержащую эти связанные с азидом молекулы сахара. Бактерии съедают сахар и используют его для строительства своих клеточных стенок. Таким образом, молекулы сахара, содержащие азидные группы, встраиваются в качестве строительных блоков в огромные молекулы сахара, находящиеся на внешней стороне клеточной стенки бактерий. На третьем этапе в бактерии добавляется специальная флуоресцентная молекула, для свечения которой не требуется кислород. Эта молекула очень точно прилипает к азидной группе на поверхности бактерии. Используя этот метод, мы создали бактерии с флуоресцентной меткой, прикрепленной к их внешней поверхности, и поэтому, освещая их определенным светом, мы можем видеть их под микроскопом и отслеживать их активность.
Взаимодействие между бактериями и клетками иммунной системы
Первое, что мы хотели пронаблюдать, - это взаимодействие бактерий с различными клетками иммунной системы в пробирке. Мы использовали макрофаги - клетки, которые можно представить себе как солдат пограничной службы (рис. 3А,Б). Макрофаги патрулируют организм, выискивая чужеродные и враждебные элементы. Как только такой элемент обнаружен, макрофаги знают, как проглотить и разрушить чужеродный элемент, в процессе, называемом фагоцитозом. Мы смешали макрофаги с флуоресцентно мечеными B. fragilis и под микроскопом увидели, как макрофаги заглатывают бактерии.
Мы также исследовали другой тип иммунных клеток - дендритные клетки (рис. 3C,D). Дендритные клетки, как и макрофаги, могут проглатывать чужеродные элементы, с которыми они сталкиваются. Кроме того, разрушив чужеродный объект, дендритные клетки представляют его части на своих клеточных мембранах в качестве "красного флажка", сигнализирующего другим компонентам иммунной системы о наличии опасности. Когда мы добавили флуоресцентно меченую B. fragilis к дендритным клеткам, то с помощью микроскопа увидели, что дендритные клетки представили флуоресцентные сахара, как предупреждающий флаг, сигнализирующий организму о встрече с бактерией.
Мы также хотели проследить за взаимодействием между флуоресцентно мечеными бактериями и клетками иммунной системы внутри организма. С помощью микроскопа нам удалось увидеть, как меченые бактерии, вызвавшие воспаление в области живота мыши, путешествуют в специальные отсеки, которые помогают остановить распространение инфекции. Во время этого путешествия мы обнаружили, что флуоресцентные бактерии прикрепляются к различным клеткам иммунной системы.
У каждой бактерии есть своя ниша
Нас интересовала и другая тема: где различные виды бактерий предпочитают селиться в пищеварительной системе? Знаете ли вы, что длина кишечника человека составляет 7,5 метра (24,6 фута)? Он выглядит как труба, многократно сложенная в области желудка, и делится на три основные части - тонкий кишечник, толстый кишечник и прямую кишку (конечная часть толстого кишечника). Некоторые бактерии микробиоты живут в нашем кишечнике с тех пор, как мы получили их от матери во время беременности. Другие попадают туда через пищу, которую мы едим. Путешествие каждой бактерии начинается в желудке, а затем она путешествует по трубам кишечника, пока не найдет наиболее подходящую среду, в которой сможет остаться и построить колонию.
Флуоресцентные B. fragilis вводили лабораторной мыши через рот, и мы наблюдали за мышью с помощью прибора, способного регистрировать флуоресцентный свет бактерии. Через 2 часа мы увидели, что большинство бактерий переместилось из желудка в тонкий кишечник, а через 12 часов большинство бактерий уже находилось в толстом кишечнике. У мышей, которых мы использовали для этого первого эксперимента, в пищеварительной системе было большое разнообразие нормальных бактерий, которые могли конкурировать с B. fragilis за места для создания колонии. Поэтому для изучения предпочтений B. fragilis к поселению в отсутствие конкуренции мы также взяли мышей, в организме которых не было ни одной бактерии, так называемых безмикробных мышей (GF). Мы добавили флуоресцентно меченых B. fragilis к GF-мышам и проследили за ними в течение нескольких дней. Мы увидели, что, несмотря на отсутствие других бактерий у мышей GF, B. fragilis все равно предпочитает селиться в толстом кишечнике. Из этого эксперимента мы сделали вывод, что толстый кишечник, вероятно, имеет оптимальные условия для жизни B. fragilis.
В последней части нашего эксперимента мы пометили три вида бактерий тремя разными флуоресцентными цветами, используя тот же метод, который мы описали ранее. Таким образом, мы могли различать три типа бактерий по мере их отслеживания. Мы ввели все три вида бактерий в организм мыши и через некоторое время проверили, где поселился каждый вид. Мы увидели, что каждый тип поселился в своей уникальной среде! Внутри кишечника живут сотни, если не тысячи, бактерий. Наша работа и работы других ученых показывают, что разные типы бактерий селятся в разных областях кишечника, и это один из способов, с помощью которого им удается уживаться вместе.
Резюме
Подводя итог, можно сказать, что в рамках нашего исследовательского проекта мы разработали метод маркировки анаэробных бактерий флуоресцентными маркерами разных цветов в отсутствие кислорода. С помощью этого метода мы смогли увидеть, как грамотрицательные бактерии кишечника взаимодействуют с определенными иммунными клетками как в лабораторных условиях, так и в организме мышей. Мы увидели, что различные бактерии выбирают определенную среду, в которой они поселяются в кишечнике, как в условиях конкуренции с другими бактериями, так и в отсутствие таковой.
Эта работа важна, поскольку анаэробные бактерии составляют подавляющее большинство микробиоты нашего кишечника. Их маркировка и отслеживание помогут нам понять их роль в физиологии нашего организма.
