Молекулярные фонарики, которые освещают науку
Эта статья основана на интервью между профессором Мартином Чалфи и Ноа Сегев.
Ученые исследуют вещи путем наблюдения. Они наблюдают за интересующим их явлением и пытаются понять его, используя самые современные инструменты, которые у них есть. Ученым часто бывает сложно увидеть и измерить то, что они хотят изучить, часто потому, что они хотят выйти за рамки ранее увиденного. Развитие современных методов визуализации позволило ученым увидеть то, что они не могли увидеть раньше. В этой статье я расскажу вам об одном из таких прорывов в области визуализации, основанном на чудесном светящемся белке под названием зеленый флуоресцентный белок (GFP). GFP изменил не только мою жизнь, но и жизнь многих других ученых, а в конечном итоге и многих людей, не являющихся учеными. Помимо прочего, GFP позволяет нам обнаруживать и наблюдать за активностью белков и целых клеток у живых животных, а также определять активность генов, кодирующих определенные белки. Надеюсь, к концу этой статьи вы поймете гораздо больше о GFP и о том, как он освещает науку.
Профессор Мартин Чалфи получил Нобелевскую премию по химии в 2008 году совместно с профессором Осаму Шимомурой и профессором Роджером Тсиеном за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка GFP.
Светящаяся медуза и чудесная ошибка
Посчастливилось ли вам когда-нибудь увидеть удивительно красивое явление - светящегося светлячка, озаряющего темную ночь? Светлячки относятся к удивительной группе организмов, способных излучать свет - это явление называется биолюминесценцией. К биолюминесцентным организмам также относятся светящиеся черви, некоторые виды бактерий и некоторые виды рыб. Наша история начинается с биолюминесцентной медузы под названием Aequorea victoria , или сокращенно A. victoria (рис. 1).
В 1960-х годах японский ученый по имени Осаму Шимомура хотел понять, как биолюминесцентные организмы производят свет. Он решил поработать над A. victoria, которая излучает зеленый свет. Осаму работал целое лето, пытаясь заставить клетки A. victoria светиться (как это происходит в море), но ни один из его экспериментов не увенчался успехом. Однажды вечером, когда на улице уже стемнело и Осаму хотел идти домой ужинать, он выбросил образцы белков A. victoria из другого неудачного эксперимента в раковину лаборатории и выключил свет, чтобы закрыть лабораторию. Но когда он уже собирался уходить, то заметил, что раковина светится голубым светом. Поскольку в раковине также находилась морская вода, Осаму решил, что что-то в морской воде должно вызывать свечение. Вскоре он понял, что кальций в морской воде заставляет белки медузы светиться. Он назвал светящийся голубым светом белок aequorin, по названию медузы [ 1, 2 ].
После этого великого открытия Осаму предстояло ответить на другой животрепещущий вопрос: почему эйкорин излучает синий свет, в то время как медуза, из которой он получен, светится зеленым? Очищая белок aequorin, Осаму искал что-то еще, что могло бы создавать зеленый свет, излучаемый A. victoria. В конце концов он нашел другой белок, который оказался флуоресцентной молекулой, потому что он принимал синий свет, будь то от эйкорина или от ручной лампы, и преобразовывал его в зеленый. Это было еще одним удивительным открытием, поскольку в то время никто и понятия не имел, что белки могут быть флуоресцентными. Хотя первоначально Осаму назвал этот белок зеленым, сейчас мы называем его зеленым флуоресцентным белком, или GFP [ 3 ]. Эта история также является прекрасным примером того, что многие научные открытия происходят совершенно случайно. Роль ученого, как в случае с Осаму, заключается в том, чтобы замечать, удивляться и исследовать эти случайные открытия.
Как GFP изменил мою жизнь
Во вторник, 25 апреля 1989 года, в обеденный перерыв в своем университете я услышал лекцию о работе Осаму Шимомуры над GFP. Как только я услышал о GFP, я был очарован. Моя лаборатория работала над крошечным (около 1 мм в длину) прозрачным червем под названием Caenorhabditis elegans, или C. elegans. Мы изучали группу нервных клеток червя, которые реагируют на физические раздражители, такие как прикосновение и звук, и преобразуют их в электрические и химические сигналы. Мне стало интересно, сможем ли мы найти способ заставить эти нервные клетки C. elegans производить GFP, чтобы мы могли увидеть и изучить их совершенно по-новому. GFP можно было бы использовать в качестве биологического маркера, то есть биологической молекулы, за которой ученые могут наблюдать, чтобы узнать, что происходит внутри клеток или организмов. В то время метод, который мы использовали, чтобы увидеть конкретные типы клеток в C. elegans, был громоздким и не позволял работать с живыми тканями. Это были серьезные ограничения. Сначала нам пришлось "фиксировать" червяка химическими веществами, чтобы сохранить структуру клеток, но этот процесс также убивал животное. Это означало, что наш нынешний метод давал нам лишь "моментальное" представление о том, что происходит внутри червя - один "кадр" за раз. Я подумал, что GFP может позволить нам увидеть нервные клетки C. elegans, пока он жив и взаимодействует с окружающей средой.
Я был так взволнован, что даже не смог дослушать лекцию до конца. Все, о чем я мог думать в течение следующих нескольких дней, - это GFP и его потенциал для моих исследований. Я связался с исследователем по имени Дуглас Прашер, который работал над созданием и копированием генетических инструкций (ДНК), кодирующих белок GFP. Мы оба были воодушевлены возможностью использования GFP в C. elegans и других организмах, поэтому решили сотрудничать. После того как мы потеряли связь на несколько лет из-за досадного недоразумения, мы вновь встретились в сентябре 1992 года, когда в мою лабораторию пришла студентка по имени Гия Эускирхен, заинтересовавшаяся проектом. Она имела хороший опыт работы с флуоресценцией, и это напомнило мне о моей идее использовать GFP для маркировки живых клеток. Изучая научные работы, опубликованные по GFP, мы обнаружили, что Дуглас недавно опубликовал работу по GFP [ 4 ], и снова связались с ним. Вскоре он прислал нам ДНК, кодирующую GFP, и Гия начал работать с ней.
Заставить организмы светиться с помощью GFP
Когда Гия начала свои эксперименты с GFP, она хотела посмотреть, станут ли бактерии, содержащие ДНК, кодирующую GPF, флуоресцентными. В то время мы не знали, достаточно ли производства белка GFP из ДНК GFP, чтобы клетка стала флуоресцентной (подробнее о том, как белки производятся из ДНК, читайте в этой статье). Возможно, необходимо что-то еще - либо что-то, что вырабатывает сама клетка и добавляет к белку GFP, чтобы он стал флуоресцировать, либо что-то, что должно быть добавлено извне, чтобы заставить клетки флуоресцировать.
Первое решение, которое мы должны были принять в начале эксперимента, касалось того, что делать с ДНК GFP, которую мы получили от Дугласа. ДНК, которую прислал нам Дуглас, содержала дополнительные последовательности, помимо участка, кодирующего GFP (рис. 2А). Мы знали, что нам нужно сделать много копий ДНК GFP для наших экспериментов, и вопрос заключался в том, использовать ли ДНК GFP Дугласа как есть (с дополнительными частями) или работать только с той частью, которая кодирует GFP. Сложность заключалась в том, что метод получения только кодирующей ДНК, называемый полимеразной цепной реакцией (или ПЦР - вы можете знать его по ПЦР-тестам на COVID-19) [ 5 ], часто вносил ошибки в скопированную ДНК. Несмотря на это ограничение, я решил, что мы будем использовать ПЦР, поскольку нам предстояло изучить миллионы бактерий, и некоторые из них будут иметь ДНК GFP без ошибок.
Как оказалось, мы выбрали правильную стратегию. Гия использовала ПЦР для копирования ДНК GFP. Затем она включила эту ДНК GFP в молекулу ДНК, называемую плазмидой, которую бактерии "проглатывают" и интегрируют в свою собственную ДНК. После облучения синим светом кишечных палочек, содержащих ДНК GFP, они флуоресцировали [ 6 ]. (В отличие от других групп, которые использовали оригинальную ДНК GFP с дополнительной ДНК, флуоресценции не наблюдалось. Что-то в дополнительной ДНК мешало производству GFP. Если бы мы не использовали ПЦР, наш эксперимент не удался бы). Поскольку наш метод работал в бактериях, мы использовали его для встраивания ДНК GFP в C. elegans, о чем я изначально мечтал, и заставили этих червей тоже светиться (рис. 2В). Это открыло путь к внедрению GFP во всевозможные организмы и использованию его для различных целей.
Как GPF изменил науку
Любая новая научная разработка может дать нам лучшее понимание основных биологических или физических принципов, а также помочь в создании новых технологий. Часто первоначальное открытие со временем развивается в удивительных и неожиданных направлениях. Хорошим примером является открытие лазера. Чарльз Таунс, чья работа привела к созданию лазера, никогда не думал, что он пригодится в продуктовых магазинах для сканирования цен на продукты, или в звукозаписывающей индустрии для создания компакт-дисков, или в кинобизнесе для создания DVD-дисков, или в медицине для проведения лазерных операций. То же самое можно сказать и об открытии GFP - оно развивалось и будет развиваться в самых разных направлениях, способствующих развитию как фундаментальных научных знаний, так и различных технологических приложений.
В научных исследованиях GFP может использоваться как биологический маркер, рассказывающий о действии генов и их продуктов. Гены можно представить как состоящие из двух частей: кодирующей части, которая указывает, какой продукт должен быть произведен (РНК и белок), и регуляторной части, которая говорит, где, когда и сколько продукта должно быть произведено. Если последовательность ДНК GFP добавить только к регуляторной части, то GFP будет производиться и флуоресцировать всякий раз, когда "включается" нормальный ген. Если же добавить последовательность ДНК GFP к кодирующей части, то к нормальному белку будет прикреплен белок GFP, и он будет светиться, когда мы посветим на него синим светом [ 7 ]. Мы можем видеть, где белки находятся в клетках (например, в ядре, на клеточной мембране), а также наблюдать за их перемещением по живым клеткам, что было невозможно при использовании более ранних методов. Важно отметить, что после вставки ДНК GFP в ДНК организма она может быть передана потомству этого организма, что делает экспериментальное использование GFP очень удобным.
Я хотел бы кратко упомянуть о двух открытиях, сделанных с помощью GFP, которыми я лично восхищаюсь. Первое было сделано Клиффордом Брангвинном и Энтони Хайманом в 2009 году [ 8 ]. Они изучали белки в цитоплазме - жидкости, заполняющей пространство внутри клеток. До этого момента люди считали, что цитоплазма довольно однородна, но когда ученые посмотрели на определенный цитоплазматический белок, помеченный GFP, оказалось, что он содержится в частицах, которые отделены от остальной цитоплазмы. Эти частицы вели себя как крошечные капли масла в воде - иногда они собирались вместе и сливались, а иногда разделялись на две части. Эти структуры не смешивались с остальной цитоплазмой, они представляли собой отдельную фазу (их часто называют фазово-разделенными частицами (рис. 3А)). Это открытие оказалось исключительно важным для нашего понимания структуры и функции клеток и открыло очень активную область исследований.
Еще одно применение GFP, которое мне особенно нравится, было сделано Джеффом Уолдо [ 9 ]. Джефф нашел умный способ использовать GFP для наблюдения за сворачиванием белков; он назвал его "репортером сворачивания". После того как белок производится в виде длинной цепочки строительных блоков, называемых аминокислотами, он должен свернуться в определенную трехмерную структуру, чтобы выполнить свою функцию. Если белок складывается неправильно, он не будет работать должным образом. Когда мы изучаем белки, например, создавая их в бактериях, мы хотим убедиться, что они складываются правильно. Джефф сконструировал ДНК, которая кодировала как интересующий его белок, так и GFP. Он рассудил, что если интересующий его белок не складывается должным образом, то GFP тоже не будет складываться должным образом и не будет светиться. Таким образом, если он видел флуоресцирующие клетки, он мог сделать вывод, что интересующий его белок свернулся правильно, а если флуоресцирующих клеток не было, он мог сделать вывод, что белок свернулся неправильно. Это очень хороший способ для ученых убедиться, что они работают с правильно свернутыми белками (рис. 3B).
Существует множество других применений GFP, поэтому я остановлюсь лишь на некоторых из них. Некоторые люди используют GFP для изучения того, как вирусы заражают клетки. В одном известном исследовании GFP окрашивали в цвет ВИЧ, вируса, вызывающего СПИД, чтобы изучить, как вирус распространяется от одной клетки к другой [ 10 ]. В ходе этого исследования было обнаружено, что вирус ВИЧ может перемещаться между клетками, не разрушая их (как это делают многие другие вирусы). Это открытие имеет отношение к тому, как можно контролировать перенос вируса из одной клетки в другую. Другие группы изучают возможности использования GFP для обнаружения мин и остатков взрывчатых веществ [ 11 ]. В Японии люди даже используют GFP для производства шелка, который светится зеленым цветом [ 12 ]. Существует множество других интересных применений GFP и других флуоресцентных белков с другими цветами, которые ученые уже нашли или создали. Эти примеры дают вам начальное представление о том, насколько полезными могут быть флуоресцентные белки.
Рекомендации для молодых умов
Я не думаю, что существует "рецепт" для проведения важных научных исследований, но есть вещи, которые я считаю важными. Одна из самых важных способностей успешного ученого - умение задавать вопросы. Многие великие вопросы сидят прямо у нас под носом и ждут, чтобы их задали, но если у нас нет привычки задавать вопросы, мы можем их пропустить. Задавать вопросы - отличный способ понять суть вещей. Когда вы узнаете что-то новое, спросите себя, как это новое можно применить к другим интересующим вас темам. Это важный подход, который я постоянно использую в своей работе. Еще одним важным аспектом задавания вопросов является проверка своих предположений (рис. 4) - почему вы верите в то, во что верите? Довольно часто, когда мы исследуем свои предположения таким образом, мы находим в них ошибки. Исправление этих ошибок путем обновления наших предположений может помочь нам расширить наши знания и понимание.
Я часто рекомендую студентам работать над двумя вещами одновременно. Таким образом, если один проект не получается, у них остается другой, в котором они могут черпать успех и мотивацию. Наука - это путь борьбы с неизвестным. Это не всегда легко и может разочаровывать, и мы совершаем множество ошибок на этом пути. Наши идеи не всегда срабатывают, но борьба с неизвестным - это захватывающая часть работы ученого. Иногда это сложное путешествие приносит большие плоды - например, мы открываем что-то, чего никто раньше не знал, а затем делимся этим открытием с другими.
Наконец, не стоит слишком беспокоиться о своих оценках. Оценки не имеют абсолютно никакого отношения к успеху в науке. Я считаю, что энтузиазм и упорство гораздо важнее оценок. Я получал средние оценки (тройки) по химии, когда учился в университете, а потом, спустя 30 лет, каким-то образом получил Нобелевскую премию по химии (мне нравится ирония в этом вопросе). Если вы интересуетесь наукой, один из лучших способов стать хорошим специалистом - это заниматься ею. Попробуйте провести эксперименты и посмотреть, каково это - это самый надежный способ понять, подходит ли вам наука.
