Превращение РНК в ДНК: Открытие, которое произвело революцию в биологии и биотехнологии
Вирусы - уникальные биологические системы. Они являются паразитами, которые используют клетки других организмов, называемых хозяевами, для размножения, часто вызывая заболевания у хозяина. Одна из самых интересных особенностей вирусов заключается в том, что некоторые из них содержат РНК в качестве генетического материала - все остальные известные организмы используют ДНК. В начале своей карьеры я работал с РНК-вирусами, пытаясь понять их базовое поведение и процессы. Когда я сосредоточился на РНК-вирусах, которые, как известно, вызывают рак, я обнаружил, что они могут создавать ДНК из своих РНК-геномов в процессе, который называется обратной транскрипцией. Это было великое открытие, которое изменило господствующий образ мышления и имело глубокие последствия для биологии, медицины и биотехнологии. В этой статье я расскажу вам о вирусах, проведу вас через открытие обратной транскрипции и опишу некоторые важные последствия наших открытий с точки зрения улучшения или даже спасения многих человеческих жизней.
Профессор Дэвид Балтимор получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1975 году совместно с профессором Ренато Дульбекко и профессором Говардом М. Темином за их открытия, касающиеся взаимодействия опухолевых вирусов с генетическим материалом клетки.
Увлекательный мир вирусов
Вирусы - это крошечные частицы, которые заражают клетки и иногда вызывают заболевания. Вирусов существует бесчисленное множество, и у каждого живого животного и даже у каждой бактерии есть свой набор вирусов. Идентифицировано более миллиона различных вирусов! Вы, вероятно, знакомы с некоторыми вирусами, например, с вирусами гриппа, вызывающими грипп; атипичной пневмонии (SARS-CoV-2), вызывающей COVID-19; или вирусом ветряной оспы (varicella-zoster), вызывающим ветрянку. Возможно, вы слышали о вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ), который вызывает СПИД, или о вирусе Эбола. Вирусы сильно различаются по своей структуре (рис. 1), по тому, сколько видов они могут инфицировать (заражают ли они только определенный вид или несколько видов), и насколько они опасны для зараженных ими организмов, которые называются хозяевами.
Вирусы размножаются, проникая в клетку хозяина и внедряя в нее свой генетический материал, который хозяин воспринимает как свой собственный. Таким образом, вирусы "порабощают" клетку-хозяина, заставляя ее производить множество копий вируса. Вирусы размножаются чрезвычайно быстро - всего за 20-30 минут у бактерий и за несколько часов у млекопитающих, включая человека. Они распространяются, перемещаясь от одного хозяина к другому. Например, некоторые вирусы могут передаваться от одного человека к другому при чихании или при прикосновении к поверхности, которой ранее касался зараженный человек. От некоторых вирусов мы можем защититься с помощью вакцинации, а с вирусами, заражающими только людей, справиться проще.
Как вы, наверное, знаете, ДНК - это молекула, которая несет генетическую информацию в живых системах. У ДНК есть родственница - РНК, которая служит переносной копией информации в ДНК и обеспечивает производство белков (подробнее о ДНК, РНК и белках читайте в статье Нобелевской коллекции о деградации белков и в статье Нобелевской коллекции о сплайсинге РНК). Все организмы в животном царстве имеют ДНК в качестве генетического материала. Вирусы уникальны тем, что некоторые из них, называемые РНК-вирусами, используют РНК в качестве генетического материала (Считается, что вирусы - это остатки более раннего мира, в котором в качестве генетической информации использовалась РНК. Подробнее об этом раннем РНК-мире читайте в этой статье). ДНК- и РНК-вирусы по-разному используют свой генетический материал для производства особого типа РНК, называемого мессенджерной РНК (мРНК) [ 1], которая используется для производства белков. Я создал систему классификации вирусов, названную Балтиморской классификацией, которая классифицирует вирусы на основе способа, которым они производят мРНК. В рамках этой классификации есть два типа ДНК-вирусов, которые используют только ДНК для создания мРНК (группы I, II), три типа РНК-вирусов, которые используют только РНК для создания мРНК (группы III, IV, V), и две группы вирусов, которые используют как ДНК, так и РНК для создания мРНК (группы VI, VII) [1, 2 ].
Изучение РНК-вирусов
Когда я начинал свою научную карьеру в 1960-х годах, я хотел работать над фундаментальной химией жизни. Мне казалось, что вирусы предоставляют для этого наилучшие возможности, поскольку они являются простейшими организмами в мире. Мы могли бы изучать вирусы и детально разбираться в их работе - вплоть до молекулярного уровня.
В 1960-х годах мы очень мало знали о том, как реплицируются РНК-вирусы. Сначала я работал с полиомиелитоподобным РНК-вирусом, растущим на мышах (группа IV по Балтиморской классификации, очень похожий на SARS-CoV-2), пытаясь понять, как этот вирус размножается и как он влияет на жизнь хозяина. Я расшифровал механизм репликации этого полиомиелитоподобного вируса, а затем распространил полученные данные на другие РНК-вирусы. В ходе этого процесса я открыл несколько важных белков, называемых ферментами, которые создают ДНК и РНК [ 3 , 4 ].
Примерно в 1970 году я заинтересовался тем, существуют ли другие, еще не открытые способы репликации РНК-вирусов. Особенно меня интересовали РНК-вирусы, вызывающие рак, так называемые РНК-опухолевые вирусы. Когда я начал изучать эти вирусы, я и не подозревал, что меня ждет большой сюрприз.
Обратная транскрипция
В 1960-х годах мой коллега по имени Говард Темин предположил, что опухолевые РНК-вирусы могут копировать свою РНК в ДНК. Ни у кого не было четких доказательств того, что это так, и многие люди не верили в это, поскольку преобладало убеждение (называемое "центральной догмой"), что РНК создается из ДНК (в процессе, называемом транскрипцией), а не наоборот (рис. 2). Тем не менее в копировании РНК в ДНК не было ничего невозможного, ведь РНК и ДНК - очень похожие молекулы, которые воспроизводятся с помощью схожих механизмов. В 1970 году я решил проверить гипотезу о том, что РНК может быть скопирована "обратно" в ДНК. Для этого я открыл РНК опухолевых вирусов и добавил радиоактивные предшественники ДНК (вставка 1). Это строительные блоки, которые позволяют нам обнаружить присутствие любой ДНК в образце, поскольку она становится радиоактивной. В течение нескольких дней экспериментов я смог показать, что образец РНК опухолевых вирусов может производить ДНК [4].
Вставка 1 - Обнаружение ДНК в РНК опухолевых вирусов.
Процесс, в ходе которого я использовал радиоактивные предшественники для открытия ДНК, выглядел следующим образом: Я купил готовые нуклеотиды (строительные блоки ДНК - А, Т, С и G), которые были помечены радиоактивным водородом. Я поместил вирус и меченые нуклеотиды в пробирку и использовал моющее средство, чтобы разрушить жировую мембрану, покрывающую вирус. Затем меченые нуклеотиды связались с РНК вируса и ферментом обратной транскриптазы, который копирует РНК в ДНК. Я добавил немного магния, необходимого для работы фермента, и поместил его в ванну с температурой 37°C. Фермент строил радиоактивную ДНК из меченых нуклеотидов. С помощью ситечка я отделил длинные молекулы ДНК от остатков меченых нуклеотидов и, используя детектор радиации, обнаружил, что молекулы ДНК были радиоактивными! Чтобы доказать, что молекула действительно является ДНК, я использовал фермент ДНКазу, который расщепляет ДНК. Когда я добавил ДНКазу к продуктам реакции и снова отфильтровал их с помощью ситечка, я не получил радиоактивного сигнала. Это доказывало, что материал, который я измерил в первоначальной реакции, определенно был ДНК.
Мои выводы означали, что РНК-опухолевые вирусы могут создавать ДНК из своих РНК-геномов, поскольку другого возможного источника ДНК в эксперименте не было. Я также показал, что если удалить РНК из образцов, то ДНК в них не обнаружится. Это было огромное открытие того, что сейчас называется обратной транскрипцией, за которое я вместе с Ренато Дульбекко и Говардом Темином получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1975 году - всего через 5 лет после моих экспериментов.
Новый фермент, преобразующий РНК в ДНК
Когда я открыл обратную транскрипцию, было известно, что РНК и ДНК копируются ферментами, поэтому я знал, что в частицах вируса есть фермент. В то время мы не знали, какой фермент преобразует РНК в ДНК, и не понимали, как этот фермент работает. Мы с коллегами работали еще 10 лет, чтобы открыть фермент, участвующий в обратной транскрипции, и расшифровать сложный механизм, с помощью которого он копирует РНК в ДНК. Для этого мы разработали новую систему, в которую можно было добавлять известные молекулы РНК и изучать, что из них получается. Эта система позволила нам наблюдать за химическими реакциями, которые никто раньше не видел. Мы нашли фермент, который копирует РНК в ДНК, и назвали его обратной транскриптазой [ 5 ]. Через несколько лет после того, как мы нашли этот фермент, ученые из других исследовательских групп выяснили его структуру с помощью метода визуализации, называемого рентгеновской кристаллографией (подробнее об истории рентгеновской кристаллографии читайте в этой статье Нобелевской коллекции). Эти ученые обнаружили, что обратная транскриптаза имеет структуру, напоминающую руку, с "пальцами", подвижным "большим пальцем", который может открываться и закрываться, и центральной областью, называемой активным сайтом, где из РНК создается ДНК (рис. 3).
Новые методы лечения вирусных инфекций и рака
Наше открытие обратной транскрипции и обратной транскриптазы имело серьезные последствия как для понимания основных молекулярных процессов в клетках, так и для лечения заболеваний. Во-первых, наше открытие открыло путь к пониманию типа вирусов, называемых ретровирусами. Ретровирусы - это РНК-вирусы, которые используют обратную транскрипцию для создания вирусной ДНК из вирусной РНК. Затем эта вирусная ДНК интегрируется (вставляется) в ДНК клетки-хозяина (с помощью другого вирусного фермента, называемого интегразой), становясь частью генетического материала клетки-хозяина (рис. 4). После того как вирусная ДНК интегрируется в ДНК хозяина, хозяин вырабатывает вирусные белки, которые собираются в новые вирусные частицы.
ВИЧ, вызывающий СПИД, - один из известных и очень проблемных ретровирусов (подробнее о ВИЧ и СПИДе читайте в этой статье Нобелевской коллекции). ВИЧ был обнаружен в 1983 году, примерно через 2 года после того, как СПИД стал глобальной пандемией. ВИЧ был обнаружен на основе его обратной транскриптазы, и были разработаны лекарства для лечения СПИДа. Если бы мы не открыли обратную транскриптазу в 1970 году, примерно за 10 лет до появления СПИДа, то, вероятно, не смогли бы обнаружить вирус, и мы бы еще долго пытались понять, почему возникает СПИД. Относительно быстрое открытие ВИЧ спасло и улучшило жизнь многих людей, которым повезло бы меньше, если бы СПИД появился до открытия обратной транскриптазы.
Наше открытие также сыграло ключевую роль в лечении рака. До нашего открытия то, как РНК-вирусы вызывают рак, было загадкой. При раке клетки переходят от контролируемого роста к бесконтрольному, иногда превращаясь в большие массы, называемые опухолями, в тканях организма или в быстро растущие клетки в крови, как в случае с лейкемией. Поскольку РНК, как правило, является нестабильной молекулой, не было смысла в том, что РНК может вызывать постоянные изменения в поведении клетки. Однако ДНК - очень стабильная молекула, и было обнаружено, что РНК-вирусы опухолей осуществляют обратную транскрипцию, копируя свою РНК в ДНК и, по сути, превращая себя в гены клеток, которые они заражают. Затем вирусы привносят в клетку новые гены, которые производят белки. Вирусные белки могут перекрывать гены хозяина и заставлять клетку постоянно расти и делиться, превращая инфицированную клетку в раковую.
Связь между раком и генами, которую мы обнаружили, изучая РНК опухолевых вирусов, оказалась очень важным процессом в развитии рака. Наше открытие дало одну из версий того, что происходит в раковых клетках, и оказалось верным для множества видов рака, а не только для тех, которые вызываются вирусами. Наша идея о том, что рак может быть генетической проблемой, расширила область исследований рака и послужила толчком к открытию спасительных лекарств, включая "чудо-препарат" под названием Gleevec, который блокирует определенные белки, дающие сигнал клеткам к росту. В основе разработки этих лекарств лежало понимание того, что определенный ген вызывает конкретный вид рака. Когда мы можем подавить активность определенного белка, который вырабатывается этим геном, мы можем подавить рак.
Использование в биотехнологии и генной терапии
Наше открытие также способствовало развитию биотехнологии, которая часто предполагает создание нужных белков для различных применений, в том числе лекарств. Одним из первых вопросов, который мы задали после открытия обратной транскриптазы, был следующий: может ли она копировать любую РНК или только вирусную? Оказалось, что обратная транскриптаза может копировать любую РНК в ДНК, если дать ей в качестве "стартера" маленький кусочек ДНК, комплементарный той РНК, которую мы хотим скопировать. Это означало, что мы можем превратить любую мРНК - шаблон для создания белка - в ДНК, фактически превратив ее в ген. Как только мРНК превращалась в ген, мы могли поместить этот ген в клетки (например, в бактерии), которые могли производить много мРНК, а затем белки из этого гена. Эта способность превращать любую мРНК в ДНК и затем создавать множество копий нужного белка стала революционной для биотехнологической промышленности и привела к разработке множества новых лекарств.
Ретровирусы широко используются в генной терапии, как инструмент для лечения генетических заболеваний [ 7 ]. Один из очень успешных примеров применения ретровирусной генной терапии - лечение пузырчатой болезни младенцев, официально называемой тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). У таких младенцев не функционирует иммунная система, поэтому любая инфекция для них смертельна. Раньше такие младенцы жили в пластиковых пузырях, которые отделяли их от внешней среды, чтобы они не заболели. Сегодня новые ретровирусные генные терапии, которые заменяют поврежденные гены младенцев на функционирующие гены, позволяют восстановить их иммунную систему и жить нормальной жизнью.
Изначально я не был нацелен на изучение болезней и попытки вылечить людей. Изначально меня интересовала только фундаментальная наука. Мне были интересны вирусы, я хотел понять их и то, как они влияют на своих хозяев. Но оказалось, что новые знания, которые я помог открыть, имели и до сих пор имеют огромное значение для биотехнологий и некоторых областей медицины". Это один из примеров повторяющейся темы в науке: улучшение жизни и даже спасение жизни часто происходит благодаря новым научным знаниям.
Рекомендации для молодых умов
Когда я работаю со студентами, я поощряю их быть как можно более независимыми - самостоятельно думать о проблемах и их решениях и работать над этими проблемами в лабораториях, которые поддерживают их стремление быть независимыми. Молодым студентам часто трудно работать самостоятельно, но они должны это делать, потому что наука основана на работе и знаниях отдельных ученых. Сейчас мы уделяем большое внимание сотрудничеству и совместной работе, и это очень важно. Но в конечном итоге именно воображение, знания и упорный труд отдельных ученых приводят к таким открытиям, как обратная транскриптаза и многие другие, которые совершаются каждый день. Поэтому я призываю своих студентов и вас выбирать карьеру, которая даст вам независимость как можно раньше и позволит найти свой собственный путь в науке (рис. 5). Это означает, что вы не просто подражаете тому, как ведут научную работу ваши руководители и консультанты, а находите свой уникальный путь. Чтобы провести успешное исследование, вам необходимо глубоко понять тему, которой вы занимаетесь, например, конкретный организм или болезнь. Когда вы только начинаете работать в области биологии, где все сложно и требует множества различных навыков, вам необходимо иметь глубокое понимание и сосредоточиться только на одной или двух определенных проблемах, потому что это позволит вам углубить свои знания. Позднее вы, возможно, захотите более широко взглянуть на то, что происходит в других областях биологии и в других областях в
Наибольшее удовольствие как ученый я получаю от открытия новых вещей, пытаясь решить биологические проблемы. Я думаю, что это самая полезная жизнь, которую только может прожить человек, и я призываю людей двигаться в этом направлении, если их ум работает в этом направлении. Многие люди не хотят тратить свое время на решение проблем, и это нормально. Самое главное - понять, что доставляет вам удовольствие, а затем заняться этим на полную катушку. Быть ученым нелегко, как и заниматься чем-либо другим с полной отдачей и огромной глубиной. Но как только вы проникнитесь этой глубиной, она принесет вам такие плоды, которых вы никогда не добьетесь никаким другим способом.
