Революция разрешения - наблюдение за молекулами жизни с помощью электронной криомикроскопии
Эта статья основана на интервью между двумя авторами.
Структурная биология - это область, которая стремится найти структуры всех компонентов, из которых состоят живые существа - от молекул, существующих в организме человека и других животных, через молекулы, присутствующие в крошечных микроорганизмах, до молекул, из которых состоят растения. Для определения этих структур структурные биологи используют сложные методы визуализации, которые становятся все более и более точными для "видения" или определения структуры более мелких и разнообразных молекул. Электронная криомикроскопия - один из самых передовых и мощных методов визуализации. В этом методе электроны пропускаются через замороженные образцы, чтобы определить структуру отдельных молекул при увеличении, достаточном для того, чтобы увидеть атомы. Эти изображения делают еще один шаг к пониманию структуры и функций основных строительных блоков жизни. В этой статье мы расскажем вам о разработках, которые привели к так называемой "революции разрешения" в электронной криомикроскопии, частью которой был доктор Хендерсон и которая в итоге позволила ему разделить Нобелевскую премию по химии в 2017 году.
Доктор Ричард Хендерсон получил Нобелевскую премию по химии в 2017 году совместно с профессором Жаком Дюбоше и профессором Йоахимом Франком за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением.
Когда внешний вид имеет значение: Открытие структур биологических молекул
Живые существа содержат множество важных структур и процессов. Например, мы знаем, что в человеческом теле есть органы, которые состоят из клеток, а внутри этих клеток находится множество органелл и молекул, которые выполняют все функции, необходимые для поддержания жизни - производят энергию, избавляются от отходов, двигаются и защищаются от вредных факторов (Рисунок 1). Чтобы понять, как работают живые существа, и, возможно, улучшить их жизнь, нам необходимо знать, какие структуры присутствуют в биологической системе и какие действия эти структуры выполняют. Структурная биология - это область, которая занимается изучением структур биологических компонентов. В прошлом ученые сначала искали конкретные действия, которые, как мы знали, происходят в биологической системе, например преобразование одного источника энергии в другой, устойчивый тип энергии. Обнаружив активность, мы определяли молекулы, которые в ней участвуют - как правило, белки и ферменты, - и только потом определяли структуру этих молекул.
В 2000 году мир пережил революцию в понимании генетической информации (ДНК) - информации, хранящейся в наших клетках, которую мы наследуем от наших родителей. Ученые впервые составили полный "набор инструкций" (так называемую последовательность оснований ДНК) всего пакета генетической информации человека. С тех пор вместо того, чтобы искать активность, затем находить молекулу, а потом определять ее структуру, структурные биологи могут использовать генетическую информацию, которая рассказывает им обо всех ферментах и белках в организме. В 2000 году, когда был определен геном человека, около 80 % молекул, закодированных в человеческой ДНК, еще не были открыты! Это открыло совершенно новый путь в структурной биологии - теперь мы могли находить структуры молекул, не зная сначала их функций. Как мы находим структуры этих молекул? С помощью крошечных частиц, называемых электронами!
Электроны и электронная микроскопия
Электроны - это крошечные электрически заряженные частицы, присутствующие в каждом атоме. Движение электронов создает электричество, а электроны также являются источником света и других форм электромагнитного излучения, таких как рентгеновские лучи. Можете ли вы поверить, что до 1895 года никто даже не подозревал о существовании электронов? В том году электроны были впервые идентифицированы и названы Дж. Дж. Томпсоном, ученым физического факультета Кембриджского университета в Великобритании. Тридцать лет спустя, в 1935 году, Г. П. Томпсон (сын Дж. Дж. Томпсона) показал, что электроны ведут себя как частицы и волны - у них есть частота и длина волны, как и у других волн. Дж. Дж. и Г. П. Томпсоны были удостоены Нобелевских премий: за открытие электрона как частицы и за открытие электрона как волны.
Вскоре после этого ученые поняли, что если электроны ведут себя как волны, то в каком-то смысле они должны вести себя как свет - ведь свет тоже может вести себя как волна. Поэтому ученые подумали, что, возможно, они смогут использовать электроны для освещения крошечных образцов, которые они хотят рассмотреть, точно так же, как мы можем рассматривать объект глазами, с помощью камеры или обычного микроскопа, но используя электроны вместо видимого света. Так было положено начало электронной микроскопии. Электронная микроскопия - это очень мощный метод визуализации. Электроны имеют очень короткую длину волны, примерно в 100 000 раз меньше длины волны света. Длину волны можно рассматривать как параметр "масштабирования" - чем меньше длина волны, тем больше мы можем "приблизить" наш образец. Это означает, что снимки, сделанные с помощью электронов, имеют очень высокий уровень детализации, который называется высоким разрешением. Благодаря высокому разрешению электронная микроскопия может использоваться для изучения структуры крошечных молекул таким образом, который ранее был невозможен.
Как работает электронная микроскопия?
В электронной микроскопии энергичный пучок электронов выходит из источника электронов и проходит через исследуемый образец (рис. 2A). Когда электроны проходят через образец, они взаимодействуют с его атомами и дифрагируют, или отклоняются от курса, в зависимости от расположения атомов, с которыми они сталкиваются. Таким образом, электроны "улавливают" структуру материала по мере прохождения через него. После дифракции электроны собираются и фокусируются с помощью линз (подобно линзам в фотоаппарате), а затем регистрируются детектором электронов. На этом этапе у ученых есть изображение электронов, которые были дифрагированы на образце, и они должны преобразовать его в изображение самого образца. Это преобразование основано на простой физике, которая описывает связь между измеряемым объектом и полученным изображением. Преобразование зависит от многих факторов, включая длину волны электронов и используемые линзы, но обо всем этом позаботятся специалисты по микроскопии.
Проблемы электронной микроскопии
Несмотря на то что электроны могут помочь нам получить замечательные изображения молекул, при их использовании для получения изображений биологических молекул приходится преодолевать серьезные трудности. Во-первых, как говорит квантовая физика, отдельные электроны не являются "логичными" - когда вы задаете им вопрос (например, что произойдет, когда они встретят определенную молекулу), они не дают однозначного ответа, как это сделал бы человек. Вместо этого у них есть определенная вероятность (likelihood) участия в каждом из возможных исходов. В электронном мире все, что могло произойти, произошло, но с определенной вероятностью для каждого варианта. Это означает, что ученые должны собрать множество ответов от множества электронов и разумно объединить информацию, чтобы получить общий ответ. Для этого мы освещаем образец миллионами электронов и используем общее среднее значение их свойств для получения разумного ответа.
Во-вторых, электроны могут повредить образец, поскольку они очень энергичны и должны пройти весь путь через образец, чтобы попасть в детектор. Их температура может достигать примерно двух тысяч миллионов градусов Цельсия - для сравнения, вода кипит при 100°C! Эти сверхэнергичные электроны и любой другой тип энергичного излучения могут вырвать электроны из молекул образца. Это изменяет форму и свойства молекул образца, ведь биологические молекулы относительно хрупкие. Поэтому ученым сложно получить достаточно информации о структуре одной биологической молекулы до того, как она будет разрушена. Один из способов решения этой проблемы - получение изображений множества отдельных идентичных молекул - не менее 500, если речь идет об электронной микроскопии биологических молекул, - и усреднение этих изображений для получения структуры типичной молекулы. Другой способ решить эту проблему - охладить образец особым образом, чтобы сделать его более устойчивым к повреждению электронами - об этом будет рассказано в следующем разделе.
Еще одна проблема связана с тем, что электроны дифрагируют, как только оказываются рядом с атомами. Это означает, что между источником электронов и образцом должен быть абсолютно чистый путь, чтобы электроны попадали на нужные молекулы и не рассеивались из-за других молекул, даже кислорода и азота в воздухе, которые стоят на пути. Другими словами, ученые должны создать вакуум вокруг образца в электронном микроскопе. Поскольку биологические молекулы всегда находятся в водосодержащих растворах (подумайте, например, о молекулах в вашей крови), проблема заключается в том, что в вакууме вода испаряется, и образец высыхает. Такое высыхание часто повреждает биологические молекулы в образце. Преодоление этой проблемы потребовало от структурных биологов творческого подхода к использованию уникальных свойств воды.
Может ли вода оставаться жидкой при сильном охлаждении?
Вот очень интересный эксперимент, который вы можете попробовать провести дома, чтобы понять одно из уникальных свойств воды (рис. 3). Возьмите пустую банку с крышкой и наполните ее водой. Убедитесь, что в банке нет пузырьков воздуха, плотно закрутив крышку под водой, и поставьте ее в морозильную камеру. Оставьте банку в морозилке на сутки - к этому времени температура воды опустится д о-10°C ил и-20°C (обычно вода превращается в лед при 0°C). На следующий день достаньте банку из морозилки и посмотрите, превратилась ли вода в твердый лед или осталась жидкой?
Чаще всего вы увидите, что вода все еще жидкая - она была переохлаждена, то есть охлаждена до температуры ниже температуры замерзания (0°C), но не превратилась в лед. В наших экспериментах мы хотим охладить воду еще больше, до температуры ниж е-170°C, потому что при этой температуре она становится очень неподвижной и стабильной. Мы также хотим избежать образования кристаллов льда, потому что они мешают нашим измерениям. Для этого мы должны использовать специальный метод охлаждения, разработанный в лаборатории Жака Дюбоше, который в 2017 году разделил Нобелевскую премию по химии со мной, Ричардом Хендерсоном и Йоахимом Франком. В этом методе мы используем очень холодный жидкий этан или пропан (вещества, содержащиеся в природном газе и состоящие из углерода и водорода), охлажденный д о-185°C. Затем мы погружаем очень тонкую пленку воды в охлажденную жидкость этана/пропана, и она остывает так быстро - примерно за 1/1000 секунды, - что не успевает сформировать организованные кристаллы льда и остается в неорганизованной, жидкой форме [ 1 ], которую мы называем аморфным льдом. Таким образом, мы получаем переохлажденную воду.
Магическая формула горячих электронов и холодных образцов
Оказалось, что переохлажденные тонкие пленки воды отлично подходят для суспендирования биологических молекул, которые мы хотим получить с помощью электронного микроскопа. Когда мы добавляем этот этап охлаждения к процессу получения изображений, это называется электронной криомикроскопией ("крио" - сокращение от "криогенный", что означает охлаждение). Электронная криомикроскопия позволяет решить две из вышеперечисленных проблем: она стабилизирует образец, делая его более устойчивым к повреждению высокоэнергетическими электронами, и позволяет биологическим молекулам находиться в их естественной водной среде, без испарения воды под воздействием вакуума. Есть и еще одно важное преимущество: в отличие от большинства других жидкостей, вода расширяется при охлаждении ниже 4°C. Эта особенность воды помогает биологическим молекулам оставаться неповрежденными, когда они находятся в переохлажденной воде. Если бы вода сжималась при охлаждении, она бы сдавливала молекулы и, возможно, разрушала их.
Этот довольно простой, но очень эффективный метод электронной криомикроскопии позволяет получать изображения биологических молекул с недостижимым ранее разрешением. Именно поэтому его иногда называют "революцией разрешения".
На рисунке 4 приведены примеры прекрасных изображений, полученных с помощью электронной криомикроскопии. Мы имеем дело с чрезвычайно крошечными масштабами - 10 нанометров, что составляет менее 1/1000 ширины человеческого волоса! Надеемся, вы начинаете понимать всю прелесть электронной криомикроскопии.
Что ждет электронную криомикроскопию в будущем?
Электроны - лучшие частицы для визуализации крошечных биологических молекул. Чтобы дать вам представление о том, насколько они хороши, давайте сравним их с двумя другими часто используемыми частицами: рентгеновскими фотонами (похожими на частицы света, но с короткой длиной волны) и нейтронами (частицами из ядер атомов). Когда мы подсчитываем количество информации, полученной от использования определенной частицы, по сравнению с повреждениями, которые эта частица создает в образце, мы получаем показатель того, насколько хороша частица для визуализации. Согласно этому расчету, электроны в 1000 раз лучше рентгеновских лучей и в три раза лучше нейтронов! Именно поэтому я и мои коллеги начали использовать электроны вместо других частиц много лет назад. В настоящее время электронная криомикроскопия стала настолько успешной, что число структурных биологов, использующих ее, велико и быстро растет.
В области электронной криомикроскопии еще предстоит внести значительные усовершенствования. Одно из них - совершенствование детекторов электронов, которые все еще недостаточно велики и эффективны и требуют использования гораздо большего количества электронов, чем теоретически необходимо. Также было бы полезно минимизировать движение образца (как молекул воды, так и биологических молекул) при контакте с электронным пучком [ 4, 5 ]. Мы считаем, что примерно через 5 лет будут достигнуты значительные успехи в решении этих проблем. Тогда мы получим еще более мощный инструмент, который позволит нам лучше понять многие биологические вопросы, например, как устроена жизнь и как она размножается. Полученная информация может помочь нам сохранить здоровье людей, животных и растений. Электронную криомикроскопию ждет очень светлое будущее!
Рекомендации для молодых умов
Я, Ричард, хочу поделиться несколькими практическими советами, которым я следовал на протяжении всей своей карьеры. Он взят из работ Питера Медавара, который получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1960 году. После получения Нобелевской премии Питер Медавар опубликовал две книги под названием "Искусство растворимого" и "Советы молодому ученому". В своих книгах он говорил, что в науке и жизни есть много интересного и что нам должно быть интересно все. Но мы также должны выбрать то, что нам особенно интересно, и работать над этим. Более того, он говорил, что ученые должны работать над тем, что позволит успешно получить новые знания в ближайшее время - не через 100 лет, потому что это не срок жизни ученого. Его идея заключалась в том, что наука - это искусство разрешимых проблем, то есть проблем, которые можно решить. Ученые должны проводить эксперименты, которые работают сейчас, с помощью современных методов.
Когда я был молодым студентом-физиком, мне было интересно, куда движется физика, и я помню, как составлял список всех интересных тем будущего. Там были исследования термоядерного синтеза, который предполагает получение неограниченной энергии за счет слияния водорода. Затем была физика частиц высоких энергий, которая привела к открытию новых частиц, включая бозон Хиггса и многое другое. Физика твердого тела способствовала развитию компьютерной индустрии и разработке микрочипов, на которых работают компьютеры. Биофизика, астрофизика, космология, черные дыры и нейтронные звезды - вот лишь некоторые из этих интересных тем (рис. 5). Если бы я выбрал любую из этих тем для изучения, они были бы не менее интересными и захватывающими. Поэтому, если вы решили заняться наукой, вы должны выбрать то, что вам интересно, чтобы вы продолжали изучать и работать над этим без чьего-либо принуждения. Если вы заинтересованы и мотивированы, то, если у вас возникнут трудности, это не будет вас сильно беспокоить - вы просто примете их как вызов и пойдете дальше. Выбрав интересную тему, прежде чем отправиться в путь, лучше всего узнать как можно больше о различных видах деятельности, которыми вы могли бы заняться для изучения этой темы. Если через 6 месяцев или год ваших стараний выяснится, что ваша идея не так уж хороша, не стесняйтесь подумать еще раз и найти новое направление.
Сегодня наука развивается очень быстро по сравнению с прошлым. Всего 100 лет назад мы даже не знали о существовании рентгеновских лучей и электронов, а сейчас у нас есть информация обо всем геноме человека, мы владеем сложными методами работы с ДНК и можем выяснить структуру практически всего, чего захотим. Следующие 100 лет будут очень хорошим временем для жизни - и для того, чтобы быть ученым. Наслаждайтесь жизнью и вкладывайте себя в то, что вам наиболее интересно!
